(19)国家知识产权局 (12)发明 专利 (10)授权公告 号 (45)授权公告日 (21)申请 号 202111487571.9 (22)申请日 2021.12.08 (65)同一申请的已公布的文献号 申请公布号 CN 114057896 A (43)申请公布日 2022.02.18 (73)专利权人 冬青 （天津） 生物科技有限公司 地址 300380 天津市西青区经济技 术开发 区赛达新兴产业园C座6层6 -117 (72)发明人 张克礼　雷林均　 (74)专利代理 机构 北京华仁联合知识产权代理 有限公司 1 1588 专利代理师 王松艳 (51)Int.Cl. C07K 19/00(2006.01) C12N 15/62(2006.01)C12N 5/10(2006.01) A61K 39/00(2006.01) A61P 35/00(2006.01) A61P 35/02(2006.01) 审查员 王静 (54)发明名称 一种靶向ROR1和CD7的双特异性嵌合抗原受 体(CAR)及其应用 (57)摘要 本发明提供了一种靶向ROR1和CD7的双特异 性嵌合抗原受体(CAR)及其应用， 具有如下结构： ROR1 scFv‑CD7 scFv‑H‑TM‑C‑CD3ζ， 其中 “‑”为 连接肽或肽键； H为铰链区； TM为跨膜结构域； C为 共刺激信号 分子； CD3ζ为胞内信号传导序列。 该 嵌合抗原受体能够在体内、 体外抑制肿瘤生长， 延长生存周 期， 促进细胞因子分泌， 发挥协 同抗 肿瘤作用。 权利要求书1页 说明书6页 序列表8页 附图3页 CN 114057896 B 2022.09.09 CN 114057896 B 1.一种靶向ROR1和CD7的双特异性嵌合抗原受体， 其特征在于， 所述嵌合抗原受体包括 如下结构： ROR1 scFv ‑CD7 scFv ‑H‑TM‑C‑CD3ζ 其中 “‑”为连接肽或肽键； H为铰链区； TM为 跨膜结构域； C为共刺激信 号分子； CD3ζ为胞内信号传导序列； ROR1 scFv 中重链CDR1 ‑3的 序列分别如SEQ ID NO:1 ‑3所示， 轻链CDR1 ‑3的序列分别如SEQ ID NO:4 ‑6所示； CD7 scFv 中重链CDR1 ‑3的序列分别如SEQ ID NO:7 ‑9所示， 轻链 CDR1‑3的序列分别如SEQ ID N O:10‑ 12所示。 2.根据权利要求1所述的双特异性嵌合抗原受体， 其特征在于， 所述ROR1 scFv 包括如 SEQ ID NO:13所示重链可变区和SEQ ID NO:14所示轻链可变区。 3.根据权利要求1所述的双特异性嵌合抗原受体， 其特征在于， 所述CD7 scFv 包括如 SEQ ID NO:15所示重链可变区和SEQ ID NO:16所示轻链可变区。 4.根据权利要求1所述的双特异性嵌合抗原 受体， 其特征在于， 所述共刺激信号分子选 自CD28或4 ‑1BB。 5.根据权利要求1所述的双特异性嵌合抗原 受体， 其特征在于， 所述嵌合抗原 受体的氨 基酸序列如SEQ ID NO:17 所示。 6.一种核酸分子， 其特征在于， 所述核酸分子编码权利要求1 ‑4任一项所述的双特异性 嵌合抗原受体。 7.根据权利 要求6所述的核酸分子， 其特征在于， 所述核酸分子的核苷酸序列如SEQ ID NO:18所示。 8.一种免疫细胞， 其特征在于， 所述的免疫细胞表达有权利要求1 ‑4任一项所述的双特 异性嵌合 抗原受体。 9.根据权利要求8所述的免疫细胞， 其特 征在于， 所述免疫细胞为T细胞。 10.权利要求1 ‑4任一项所述的双特异性嵌合抗原受体或权利要求6 ‑7任一项所述的核 酸分子或权利要求8 ‑9任一项所述的免疫细胞在制备肿瘤药物中的应用， 所述肿瘤为白血 病或淋巴瘤。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114057896 B 2一种靶向ROR1和C D7的双特异性嵌合 抗原受体(CAR)及其应用 技术领域： [0001]本发明属于肿瘤免疫治疗领域， 具体提供了一种靶向ROR1和CD7的双特异性嵌合 抗原受体(CAR)及其制备抗肿瘤药物的应用。 背景技术： [0002]目前， 癌症已成为全球范围内致死率最高的疾病之一， 但是现有的手术切除和放 化疗等手段对早期肿瘤的治疗效果较好， 却难以治疗中晚期患者， 而且还会引起患者严重 的不良反应， 影响患者生活质量， 增加患者及其家庭负担。 近年来， 随着肿瘤 免疫治疗的发 展， 嵌合抗原受体T细胞(Chimeric  Antigen Receptor  T Cells， CART)疗法在抗癌方面取 得了巨大的成功。 这一疗法最初由Gr oss和他的同事于1989年提出， 他们将抗体的抗原结合 区scFv与CD3 ‑ζ链或FcεRIγ的胞内部分融合形成嵌合抗原受体。 CAR的基本结构包括一个 肿瘤相关抗原(tumor ‑associated  antigen,TAA)结合区(通 常来源于单克隆抗体抗原结合 区域的sc FV段)， 一个胞外铰链区(Hinge  area)， 一个跨膜区(Tran smembrane  region)和一 个胞内免疫 受体酪氨酸活化基序(Immunoreceptor  tyrosine ‑based activation  motif, ITAM)。 随后， 研究人员为了提高CART的抗肿瘤能力， 在Gross等人的研究基础上添加了共刺 激信号分子， 使得CART对肿瘤细胞的杀伤能力大幅度加强， 并在血液肿瘤治疗方面取得了 成功， 2017年诺华公司的Kymiriah(CLT ‑019和Kite制药(已被吉利德公司收购)的Yescarta (KTE‑C10)先后被美国FDA批准上市， 2019年中国首款CAR ‑T疗法阿基仑赛注射液(复星凯 特)也被批准上市， 掀起了针对嵌合 抗原受体相关抗肿瘤药物的研究热潮。 [0003]早期的CART细胞多以CD19为治疗靶点， 但是后续发现CD19不仅在肿瘤细胞中表 达， 在正常细胞中也有相对高的表达量， 造成了CART细胞的 “误判”而攻击正常细胞， 诱发毒 性反应。 为此， 研究人员开始尝试寻找新的治疗靶点， 并且试图通过构建双特异 性CART细胞 降低脱靶现象的出现， 及同时靶向两个抗肿瘤位 点， 提高识别特异性。 [0004]在这种理论指导下， 大量新型抗肿瘤靶点被开发出来， 其中受体酪氨酸激酶样孤 儿受体1(recep tor tyrosine  kinase like orphan receptor 1， ROR1)是最受瞩目的新型 靶点之一。 ROR1)是一种跨膜蛋白， 属于受体酪氨酸激酶receptor  tyrosine  kinase， RTK) 家族， 酪氨酸激酶(tyrosine  kinase， TK)作为一组肿瘤特异性抗原。 ROR1最初是在神经母 细胞瘤株中发现并被命名为神经营养酪氨酸激酶受体相关蛋白， 因为未发现其自然配体， 所以被定义为孤儿受体。 ROR  1参与细胞间信号交流， 胞内信号传导等过程， 调节细胞增殖、 分化、 转移和存活， ROR1在 多种肿瘤中高表达， 如白血病、 前列腺癌、 卵巢癌、 睾丸癌、 肾上腺 癌、 乳腺癌、 肺癌、 恶性黑色素瘤、 胰腺癌、 膀胱癌、 结肠癌等， 但在正常产后组织中微量表达 (Hojjat‑Farsangi  M,Jeddi‑Tehrani M,Daneshmanesh  AH,et al.Spontaneous  Immunity   Against  the Receptor  Tyrosine  Kinase ROR1 in Patients  with Chronic   Lymphocytic  Leukemia.PloS one.2015,10(11):e0142310.)。 正是由于这种特性， ROR1成 为了理想的抗肿瘤 靶点和肿瘤诊断标志物。 目前研究人员已经针对ROR1开 发出来多种抗体 或核酸抑制剂， 用于治疗恶性肿瘤， 但是有关ROR1的CART细胞却报道较少， 如CA2973964A1、说　明　书 1/6 页 3 CN 114057896 B 3